Il contribue à la description de très nombreuses plantes en Italie. Il succède à Ghini à la tête du jardin botanique de Pise en 1554, fonction qu'il occupe jusqu'en 1558.
Plus tard, il est appelé à Rome pour enseigner la médecine et être le médecin personnel du papeClément VIII qui le nomme professeur de médecine au collège de la Sapience.
Comme philosophe, il se fait remarquer par sa connaissance profonde des écrits d'Aristote. Ses travaux publiés restent sous l'influence d'Averroès; il y fait montre d'un certain panthéisme. Son œuvre philosophique la plus importante est Quaestionum peripateticarum libri quinque (livre paru à Florence en 1569) où il étudie la pensée d'Aristote. Il embrasse la doctrine des Averroïstes, représentant Dieu, non comme la cause, mais comme le fond et la substance de toutes choses, ce qui le fait accuser de panthéisme et même d'athéisme. Cependant, la Catholic Encyclopedia indique qu'il est resté catholique toute sa vie. Les doctrines philosophiques de Cesalpino sont combattues par Samuel Parker(1640-1688), archevêque de Cantorbéry, et par Nicolaus Taurellus(de) (médecin de Montbéliard, auteur d'un essai critique contre ses conceptions religieuses intitulé Caesae Alpes publié en 1597), qui le dénoncent à l'Inquisition.
En médecine, à la suite de son maître Realdo Colombo, il est l'un des premiers à reconnaître la circulation du sang. Il décrit la fonction des valvules veineuses et reconnait le premier le sens centripète du flux sanguin veineux (1571). Il suppose l'existence des capillaires : vasa capillarimenta resoluta. Il affirme que le sang se distribue en fines "branches" et entre en contact avec l'air dans les poumons(1583). C'est à lui que l'on doit le terme de circulation sanguine.
Comme naturaliste, il reconnait le sexe dans les fleurs. Il invente la première méthode de botanique. Il fonde sa classification sur la forme de la fleur, du fruit, et sur le nombre des graines. Son œuvre la plus importante est certainement De plantis libri XVI (parue à Florence en 1583). Ce livre est proche des herbiers antérieurs et présente une théorie botanique, proche de celle dérivée de la pensée aristotélicienne. Il décrit environ 1 500 espèces qu'il tente de classer suivant un système permettant une détermination ultérieure facile. Il suit d'ailleurs les préceptes de Théophraste. Il fait une large place à ses propres observations et expériences.
Il rejette les systèmes de classification basés sur des critères artificiels (comme le goût, les utilisations médicinales ou l'ordre alphabétique) et tente de trouver un système naturel. Contrairement aux autres herbiers, il ne contient aucune illustration, car Cesalpino estime que seul le texte permet de décrire précisément toutes les caractéristiques contrairement aux représentations graphiques. Cesalpino aborde de façon très novatrice l'étude des végétaux. Il dresse les fondements modernes de la morphologie et de la physiologie végétale. Il évoque ainsi la nutrition des plantes. Se basant sur les euphorbes qui laissent couler un jus laiteux quand on coupe une feuille, il y voit une analogie avec la circulation du sang chez les animaux. Comme Conrad Gessner, il considère que l'élément de base pour la classification est l'espèce basée sur le principe de la reproduction avec ses semblables et accorde une grande importance aux organes reproducteurs.
Il étudie également la chimie, la minéralogie et la géologie. Dans De metallicis libri tres (publié à Rome en 1596), il donne une description détaillée de fossiles.
Il meurt à Rome, à l'âge de 84 ans.
Ses principaux ouvrages, dans les éditions princeps, sont :