Acetobacter polyoxogenes
Quatorze souches de bactéries d'acide acétique ont été isolées d'un bouillon de vinaigre fermenté présentant une acidité élevée. Ces isolats étaient utiles pour la production de vinaigre à haute acidité et nécessitaient de l'acide acétique, de l'éthanol et du glucose pour leur croissance. Les isolats différaient de toutes les espèces des genres Acetobacter et Gluconobacter jusque-là validement publiées, en ce qui concerne leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques, biochimiques, biochimiques et chimiotaxonomiques et leurs homologies avec l'acide désoxyribonucléique. Les isolats sont classés comme une nouvelle espèce du genre Acetobacter et nous proposons Acetobacter polyoxogenes sp. nov. pour eux. La souche type de A. polyoxogenes est NBI 1060 (= JCM 3808).
Il existe plusieurs méthodes au Japon pour la production industrielle de vinaigre par des bactéries à acide acétique. Ils sont généralement divisés en deux méthodes: une méthode traditionnelle par culture de surface et une méthode moderne par culture immergée. L'acidité finale du vinaigre fermenté est généralement inférieure à 10%. Les souches purement isolées des bactéries de l'acide acétique ont rarement été utilisées pour la production industrielle de vinaigre au Japon. Le «vinaigre de graine», mélange de micro-organismes hétérogènes, est généralement utilisé en entrée. Différents types de développement spontané de bactéries d'acide acétique se produisent dans chacune des méthodes mentionnées ci-dessus. Les bactéries dominantes de l'acide acétique dans cette production de vinaigre seraient Acetobacter pasteurianus dans la culture de surface et Acetobacter xylinum dans la culture submergée. Cependant, l'acidité produite par ces bactéries n'est pas très élevée.
Il existe une autre méthode qui utilise la culture immergée pour produire du vinaigre avec une acidité élevée de plus de 10%. Cette méthode est importante sur le plan industriel. Cependant, les microorganismes n'ont pas été isolés d'un bouillon de vinaigre fermenté avec une acidité élevée, car les bactéries ne pouvaient pas se développer sur les supports ordinaires utilisés pour les bactéries d'acide acétique habituelles. La présente étude traite de l'isolement et de la caractérisation des bactéries de l'acide acétique qui produisent du vinaigre à haute acidité. Les isolats sont classés comme une nouvelle espèce du genre Acetobacter. Une nouvelle espèce, Acetobacter polyoxogenes, est proposée pour ces souches.
MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Isolement des bactéries. Le milieu développé et utilisé pour l'isolement était une plaque de gélose acide acétique-éthanol (AE) qui était un bouillon AE solidifié par addition d'agar à 0,5%. Sa surface a ensuite été recouverte d'un bouillon AE avec 1% d'agar. Le bouillon AE était composé de 1,5% de glucose, 0,2% d'extrait de levure, 0,3% de peptone, 6,5% d'acide acétique et 2% (v / v) d'éthanol. L'acide acétique et l'éthanol ont été ajoutés de manière aseptique. Le pH final du bouillon AE n'a pas été ajusté, mais était approximativement de 2,9. Les échantillons à isoler étaient divers types de bouillon de vinaigre fermenté recueilli dans certaines brasseries de vinaigre. Les échantillons ont été répartis sur des plaques de gélose AE et incubés à 30 ° C pendant 7 à 30 jours dans une chambre maintenue à une humidité relative de 95 à 100. Les microorganismes apparaissant sur des plaques de gélose AE ont été prélevés et purifiés par des cultures répétées en série sur une plaque de gélose AE. Lorsque des plaques ayant la force habituelle en gélose (1,5 à 2,0%) ont été utilisées pour l'isolement d'un bouillon de vigne-gar fermenté avec une acidité élevée, aucun micro-organisme n'a été obtenu. La culture sur la plaque de gélose à double couche sous forte humidité est nécessaire à la formation de colonies bactériennes de forte acidité. La couche inférieure en gélose molle fournit apparemment un environnement humide à la couche de surface. Souches bactériennes. En plus des isolats mentionnés ci-dessus, les souches suivantes ont été utilisées à des fins de comparaison: Acetobacter liquefaciens JAM 1834T, Acétobacter xylinum NCIB 11664T, IFO 3288, NBI 1002 et NBI 1003, Acetobacter hansenii NCIB 8746T, Gluconobacter cerinus IFO 3267T, Gluconobacterans oxydes. oxydans ATCC 19357T, Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans IFO 3990, Gluconobacter oxydans subsp. industrius IFO 3260, Gluconobacter oxydans sous-esp. mélanogènes IFO 3293 et ??Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467T. L'exposant "T" indique les souches qui sont les souches types de l'espèce et de la sous-espèce. Milieu de culture. Les isolats ont été cultivés sur gélose AE ou bouillon AE à 30 ° C. En culture sur des plaques de gélose AE, l'humidité relative a été maintenue entre 95 et 100%. Sauf indication contraire, les souches authentiques ont été cultivées sur une gélose au glucose-extrait de levure-peptone (GYP) contenant 3% de glucose, 0,5% d'extrait de levure, 0,2% de peptone et 1,5% d'agar.
Caractéristiques morphologiques.
La forme des cellules a été observée au microscope optique en utilisant des cellules colorées au carbol-fuchsine. La forme des cellules a également été observée avec un microscope électronique à transmission JEOL, modèle JEM-1200EX. La coloration de Gram a été réalisée par la modification de HUCKER. Les cellules développées sur des plaques de gélose AE pendant 5 à 10 jours ont été utilisées pour les observations. La motilité et la flagellation ont été observées dans les cellules cultivées sur plaque d'agar AE pendant 4 à 30 jours à 15, 20, 25 et 30 ° C. La présence de flagelles a été déterminée par la méthode de coloration de ToDA. Caractéristiques culturelles. L'aspect colonial des isolats sur la plaque de gélose AE a été observé après une incubation de 10 jours. La croissance sur des plaques de gélose nutritive, des plaques de gélose GYP, des plaques de gélose YM et des plaques de gélose AE a été observée après 30 jours d'incubation. L'agar YM était composé de 1% de glucose, 0,5% de peptone, 0,3% d'extrait de malt et 1,5% d'agar. La croissance en bouillon liquide de ces milieux a également été étudiée. Caractéristiques physiologiques et biochimiques. L'effet du pH sur la croissance des isolats a été examiné pour déterminer leur croissance après une incubation de 21 jours sur des plaques de gélose AE ajustées à un pH de 1,6, 1,9, 2,2, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 et 5,0. Le pH a été ajusté avec HCl et NaOH. L'effet de la température sur la croissance des isolats a été testé par leur croissance sur des plaques de gélose AE à 10, 15, 20, 25, 30, 35 et 40 ° C. L'effet de la concentration d'acide acétique sur la croissance des isolats a été déterminé en les faisant croître sur des plaques de gélose AE avec différentes concentrations d'acide acétique. Les isolats ont été incubés pendant 21 jours sur un milieu contenant 0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10, 12 et 14% d'acide acétique. Le pH de ces milieux était de 6,15, 3,55, 3,36, 3,22, 3,03, 2,92, 2,84, 2,77, 2,71 et 2,66, respectivement. Les souches authentiques ont été incubées pendant 21 jours à 30 ° C sur des pentes inclinées de gélose GYP contenant 0, 0,5, 1,0, 2,0 et 4,0% d'acide acétique. La croissance des isolats sur un milieu sans acide acétique, éthanol ou glucose a été observée après 21 jours de croissance sur des plaques de gélose AE dépourvues de ces composés. L'utilisation de divers composés carbonés a été examinée par la croissance sur un milieu à base d'agar AE. Etant donné que les isolats ne croissaient pas sans acide acétique, éthanol et glucose, le test était le suivant: Le glucose dans la gélose AE a été remplacé successivement par la L-arabinose, la D-xylose, la D-mannose, la D-fructose, la -galactose, maltose, saccharose, lactose, raffinose, mélibiose, tréhalose, L-sorbose, D-sorbitol, D-mannitol, inositol, glycérol ou amidon. L'éthanol dans la gélose AE a été remplacé consécutivement par le méthanol, le n-propanol, l'isopropanol, le n-butanol, l'isobutanol, l'alcool n-amylique ou l'alcool iso-amylique. Les sources de carbone ont été stérilisées séparément par filtration et ajoutées au milieu stérile à une concentration finale de 2%. Les cultures ont été incubées pendant 21 jours. La production d'acide acétique à partir d'éthanol et l'oxydation d'éthanol en CO2 et H2O ont été testés comme suit: Les isolats ont été cultivés dans un bouillon AE avec agitation et aération pendant 21 jours. Les concentrations d’acide acétique et d’éthanol au cours de la culture ont été déterminées à l’aide d’un acide carboxylique Seishin modèle 5603 analyseur d'acide (Seishin Pharmaceutical Co., Ltd., Noda, Japon) et un chromatographe en phase gazeuse Shimadzu GC-6A (Shimadzu Co., Kyoto, Japon), respectivement. L'oxydation du lactate en CO2 et en H2O a été déterminée par la méthode de SHIMWELL et al. (4). La méthode (5) de LEIFs0N a été utilisée pour tester la réaction dans l'acétate et le lactate. La consommation d'oxygène avec de l'acétate, du lactate et du succinate a été détectée par la méthode d'AMEYAMA et de KONDO (6). Pour le test de formation d'acide gluconique, d'acide 2-cétogluconique, d'acide 5-cétogluconique et d'acide 2, 5-dicétogluconique, les isolats ont été cultivés dans un bouillon AE additionné de 1,5% de glucose sous agitation pendant 4, 7, 14 et 21 jours. L'acide gluconique, l'acide 2-cétogluconique, l'acide 5-cétogluconique et l'acide 2,5-dicétogluconique ont été détectés par chromatographie en couche mince (7) et déterminés quantitativement avec l'analyseur d'acide carboxylique mentionné ci-dessus. La dihydroxyacétone du glycérol a été testée comme suit: Après avoir strié les isolats sur des plaques de gélose AE avec et sans glucose additionnées de glycérol à 3%, puis incubés pendant 4, 7, 14 et 21 jours, une partie aliquote de la solution de Fehling a été versée sur les deux sortes de plaques. Une couleur orange est apparue autour de la traînée lorsque la souche a oxydé le glycérol en dihydroxyacétone. Pour le test de réaction du chlorure ferrique dans le glucose et le fructose, un bouillon AE additionné de 3,5% de glucose et un bouillon AE contenant 5% de fructose à la place du glucose ont été utilisés. Après une incubation de 4, 7, 14 et 21 jours sous agitation, le bouillon a été testé pour déterminer la réaction de couleur violet-rougeâtre avec une solution aqueuse de chlorure de fer. Pour le test de formation de la cellulose, les isolats ont été cultivés sur des plaques de gélose AE pendant 21 jours. Les colonies résultantes ont été colorées avec de l'iode de Lugol et appliquées avec 60O H2S04. Les colonies étaient colorées en bleu vif dans les souches qui formaient la cellulose. Des plaques de gélose AE ont été utilisées pour observer la formation de pigment brun par les isolats après une incubation de 21 jours. La croissance sur le milieu-éthanol Hoyer modifié de Frateur et sur le milieu-glucose Hoyer modifié de Frateur a été observée par la méthode de SWINGS et al. (8). Les deux médias ont été complétés avec les vitamines suivantes. Un litre de milieu contient 2 tg de biotine, 400 g de pantothénate de calcium, 2 µg d’acide folique, 2 mg d’inostiol, 400 g de niacine, 200 pg d’acide p-aminobenzoïque, 400 µg de pyridoxine HCI, 200, tg de ribo-flavine et 400 µg de thiamine HC1. Les tests biochimiques de la catalase, de l'oxydase, de la formation de H25 et de la liquéfaction de la gélatine des isolats ont été examinés selon la méthode décrite par KOMAGATA, sauf que la plaque de gélose AE et le bouillon AE ont été utilisés comme milieu de culture. Les tests biochimiques suivants pour les souches authentiques ont été effectués selon la méthode décrite dans le rapport précédent (10): Oxydation de l'éthanol via l'acide acétique en CO2 et H2O, formation d'acide 5-cétoglu-conique et d'acide 2,5-dicétogluconique, dihydroxyacétone à partir de glycérol, réaction du chlorure ferrique en glucose et fructose, formation de cellulose et formation de pigment brun.
Quinones isoprénoïdes. Les isolats ont été cultivés dans un bouillon AE pendant 2 à 4 jours à 30 ° C sous agitation. Les ubiquinones ont été extraites et purifiées selon la méthode de YAMADA et al. (11). Le système à l'ubiquinone a été déterminé par la méthode décrite dans le rapport précédent (10). Composition en acides gras cellulaires. Les cellules cultivées dans un bouillon AE pendant 2 à 4 jours avec agitation ont été utilisées pour l'analyse des acides gras cellulaires. La composition en acides gras cellulaires a été déterminée par la méthode d'IKEMOTO et al. (12). Composition de base d'ADN. L'ADN a été purifié par la méthode de SAITO et MIURA (13) à partir de cellules cultivées dans un bouillon AE sous agitation pendant 2 à 4 jours. La composition de base d'ADN (teneur en G + C) a été calculée à partir de la température de fusion (14) avec un spectrophotomètre Beckman modèle DU-8 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, Californie, États-Unis). L'ADN de Escherichia coli K12 (51,0% en mole de guanine plus cytosine (% en mole de G ± C)) a été utilisé comme référence (15). Homologies ADN-ADN. Des expériences d'hybridation ADN-ADN ont été effectuées à 70 ° C selon la méthode décrite précédemment (16). Les ADN ont été marqués en utilisant le système de traduction Nick (NEK 005, New England Nuclear, Boston, Massachusetts, États-Unis). Production d'acide acétique par les isolats. La concentration finale en acide acétique produit par les isolats purifiés a été examinée à l'aide de cultures alimentées par lots, de la manière suivante: v) de l'éthanol a été chargé dans un appareil de fermentation de 3 litres. Le bouillon a été agité avec aération à une vitesse de 0,5 vm (volume d'air volume de milieu-1 min 1) à 30 ° C. Les cellules cultivées sur des plaques d'agar AE pendant 4 à 7 jours ont été utilisées pour les inoculums. Une fois que la concentration d'acide acétique a augmenté jusqu'à 8,5%, un bouillon d'alimentation contenant 1,5% de glucose, 0,20 / extrait de levure, 0,3 peptone et 50% (v / v) d'éthanol a été introduit dans le bouillon de culture à l'aide d'une pompe d'alimentation. La température de culture a été maintenue à 30 ° C jusqu'à ce que la concentration en acide acétique atteigne 12,50. Ensuite, la température du bouillon a été progressivement abaissée à 21 ° C en fonction de l'augmentation de l'acidité.
